角膜基质干细胞疗法的anti-scarring效应是由生长因子β3转型

背景

角膜基质干细胞(CSSC)减少角膜炎症,防止纤维瘢痕,再生透明角膜基质组织受伤。这些影响依赖因素由CSSC阻止纤维化的基因表达。本研究调查的机制无疤痕再生效果。

方法

主要人类CSSC (hCSSC)从供体角膜轮辋培养通道3和老鼠巨噬细胞RAW264.7细胞诱导培养M1炎性表型interferon-γ治疗和脂多糖或interleukin-4 M2抗炎表型,Transwell系统。人类的时间进程表达式转化生长因子β3 (hTGFβ3)和hTGFβ1被免疫荧光和qPCR检查。TGFβ3击倒在hCSSC > 70% (hCSSC-TGFβ3 (si)]是通过小干扰RNA转染。天真CSSC和hCSSC-TGFβ3 (si)在纤维蛋白凝胶鼠标眼角膜移植,分别受伤后基质消融。角膜透明度和小鼠炎症和纤维化的基因的表达。

结果

hTGFβ3被hCSSC调节原始细胞M1条件下培养。hCSSC受伤鼠标眼角膜移植的显示的重要upregulation hTGFβ3具有抑制受损,延伸在天1和3和减少小鼠炎症基因的表达(CD80、C-X-C主题趋化因子配体5、lipocalin 2,纤溶酶原激活物尿激酶受体pro-platelet碱性蛋白,和磷蛋白质分泌1)。到了14天,hCSSC治疗显著降低纤维化和瘢痕组织基因的表达(纤连蛋白,透明质酸合酶2,分泌蛋白酸和半胱氨酸丰富,tenascin C,胶原蛋白3 a1和α-smooth肌肉肌动蛋白),眼角膜受伤依然清晰。然而,hCSSC-TGFβ3 (si)失去了这些抗炎和anti-scarring功能,和受伤的眼角膜显示强烈的疤痕。

结论

本研究表明hCSSC的角膜再生效果是由TGFβ3,诱导无疤痕组织的反应。

失明是一个全球性的负担。角膜瘢痕由于外伤或感染是一个失明的主要原因,全球约有1000万人受影响(1]。大多数现有的常规治疗角膜疤痕是角膜移植(渗透或角膜成形术)(2]。尽管这个过程被认为是一种高度发达的、成功的治疗,它受到全球移植供体材料的短缺,同种异体移植物免疫反应,长期移植物生存和并发症,和外科专业知识的需要1]。有明确需要新的方法来预防和治疗角膜瘢痕。角膜基质干细胞(CSSC)中确定前缘的基质,代表的间叶细胞祖细胞基质,可见,角膜基质内的主要细胞类型(3]。优化文化条件下,早期人类CSSC (hCSSC)主要段落具有干细胞特性,包括干细胞的克隆生长和表达标记(CD73, CD90 CD166 SSEA4, OCT4、ABCG2,巢蛋白和Pax6),以及区分能力,可见当特定细胞因子引起的,和可以忽略不计fibroblast-related基因的表达,如α-smooth肌肉肌动蛋白(αSMA)和tenascin C (TNC) [4,5,6,7]。使用不同的动物模型,包括lumican基因敲除小鼠角膜基质消融,hCSSC预防纤维组织形成的应用,减少基质阴霾,恢复角膜基质胶原原纤维微观结构和角膜透明度(8,9,10,11]。治疗角膜再生组织胶原细胞外基质(ECM),类似于本机角膜基质(12,13]。这些发现证明hCSSC修复基质损害的治疗潜力,重新生成透明角膜。从一个供体角膜体外传播使得细胞用于多个收件人或多个治疗,因而无需供体材料的短缺14,15]。

的潜在机制CSSC减少角膜纤维化和瘢痕,以及再生的间质组织,尚未阐明。在低的有丝分裂原,培养ascorbate-containing媒体,hCSSC表示一组基因的特点,可见(3]。平行对齐的纳米纤维的基础上培养时,细胞层沉积胶原原纤维的包装在一个高度有组织的模式,类似于本机基质片晶(15,16]。后注入小鼠角膜基质,添加细胞仍然可行的几个月,和出现静止,可见,可见的典型基因表达和生产人类ECM组件(8,9,17]。这些观测结果强烈表明,默认CSSC区分成角膜细胞谱系和获得角膜细胞功能。此外,hCSSC注入小鼠角膜基质T-cell-mediated事实并没有引起免疫反应,这表明他们的免疫耐受能力和阻止炎症信号(8,11]。生产TSG-6(肿瘤坏死factor-stimulated基因6)受伤的眼角膜进一步证明hCSSC阻止中性粒细胞浸润的能力,从而减少myofibroblast分化和scar-associated基因表达,包括胶原蛋白3 a1 (Col3a1) tenascin C (TNC)和α-smooth肌肉肌动蛋白(αSMA) [18]。最近,我们已经表明,hCSSC诱导角膜再生通过一个间接的信息交互,产生影响的旁分泌细胞外囊泡(19]。这样的治疗效应消失当小分子核糖核酸的囊泡是枯竭的,特定的阿历克斯击倒后,表明某些小分子核糖核酸可能对角膜纤维化和基质再生治疗的影响。CSSC是否由其他机制促进组织再生,尤其是无疤痕愈合反应生产透明的角膜,正在调查中。

伤口愈合是由各种生长因子,包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、白细胞介素(如il - 1、2、6、8)和肿瘤坏死factor-α(TNFα)[20.,21,22]。在不同的器官,包括角膜、转化生长因子β(TGFβ)家族被称为纤维化和瘢痕形成的关键调节因素;通过机制规范化TGFβ/ Smad信号(23,24,25]。目标抑制和调制TGFβ信号使用小型干扰rna (siRNA)或中和抗体调节纤维化和调节伤口愈合已报告在不同的研究26,27,28]。TGFβ家族包括三个密切相关的亚型(β1β2和β3),不同的角色在细胞分化、组织再生和胚胎发育(29日]。TGFβ1和β2调解组织纤维化和瘢痕形成30.,31日),而TGFβ3作为抑制剂这些事件(32]。anti-fibrotic和无疤痕愈合TGFβ3已报告在皮肤、肺和肾脏模型(33]。

在这项研究中,我们检查了TGFβ3表达hCSSC pro和抗炎的条件下,模拟不同场景的组织损伤和伤口愈合的过程。TGFβ3及其击倒的角色表情的基质再生功能hCSSC也研究了使用鼠标角膜伤口模型。

人类角膜活组织检查

人类corneal-scleral钢圈(n= 4),从消除识别信息捐助者60岁以下研究和批准使用,得到中心的器官恢复和教育,美国宾夕法尼亚州匹兹堡市。组织使用不到9天post-enucleation和保存在前GS(博士伦公司,罗切斯特,纽约,美国)。研究遵循赫尔辛基宣言的原则,匹兹堡大学的机构审查委员会批准(IRB)和监督委员会研究和临床培训涉及死者们(CORID协议# 161)。

人类角膜基质干细胞隔离和文化

角膜边缘,去除角膜上皮和内皮细胞后,被解剖分离前缘的基质(1 - 2毫米宽,0.5毫米深),然后切成小段进行消化(16 h在37°C)与胶原酶(0.5毫克/毫升,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),如前所述[10]。单个细胞悬液细胞是通过过滤器(70μm孔隙大小,康宁,纽约,美国)和细胞被播种文化表面上涂有FNC混合(雅典娜,巴尔的摩,马里兰州,我们)与干细胞生长培养基(JM-H)含2%汇集人类血清(创新Res,诺维、MI、美国)(34]。70%的融合,主要收集细胞后短暂的消化与TrypLE表达(热费希尔,沃尔瑟姆,妈,我们)和镀10细胞/厘米²克隆细胞生长在随后的段落。CSSC从一个供体角膜被扩大到P3用于实验。培养细胞对间充质干细胞(MSC)表示特定标记(包括CD73, CD90和存在),和成人干细胞(包括ABCG2、巢蛋白、Pax6 NGFR)通过流式细胞术和rt - pcr (7,10]。

TGFβ3在小干扰rna转染人类CSSC击倒

人类CSSC洗两次去除死细胞和碎片。在新鲜培养基,添加的Viromer蓝色转染贴壁细胞的转染试剂(OriGene,罗克维尔市,医学博士,美国),Viromer蓝色缓冲和siRNA特定hTGFβ3(42海里;Ambion;反义序列:UCA GAG UGU ACA GUC CCA)或炒序列(消声器™选择负控制# 2,Ambion),根据制造商的协议。24小时后,细胞被放置在一个Transwell体系和培养生在M1感应在下一节(方法)44 h。总蛋白质样本收集hTGFβ3和hTGFβ1表达蛋白免疫印迹。

体外炎症试验

在Transwell系统中,老鼠巨噬细胞RAW264.7细胞(美国类型细胞收集、写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)镀在10⁴细胞/厘米²在DMEM / F-12(热费希尔)与10%胎牛血清(的边后卫,热Fisher)在众议院。他们被治疗诱导M1表型interferon-γ(IFN-γ30 ng / ml;圣地亚哥BioLegend CA,美国)和脂多糖(LPS, 100 ng / ml;Sigma-Aldrich)或通过interleukin-4 M2表型(il - 4, 20 ng / ml;BioLegend)。在2×10 hCSSC被播种⁴细胞/厘米²在参议院和培养附近汇合前议会下议院有原始细胞共培养。72 h,定期收集原始细胞的表达M0、M1和M2表型标记,当hCSSC化验hTGFβ1和hTGFβ3表达式。

定量逆转录-聚合酶链反应(qPCR)

细胞细胞溶解RLT试剂(试剂盒,日耳曼敦,医学博士,美国)和总RNA提取使用RNeasy Miniprep(试剂盒)其次是RNase-free DNase消化(新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,妈,我们根据制造商的指示。RNA被乙醇沉淀和量化使用NanoDrop(热费希尔)之一。逆转录后使用上标三世rt - pcr试剂盒(热费希尔)和随机hexanucleotide底漆,互补dna化验了候选基因表达与特定TaqMan探针使用普遍掌握混合(热费希尔)或特定目标引物(表1)使用SYBR绿色实时掌握混合(生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国)在StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司,促进城市、钙、美国)。实验运行在一式三份。RNA的相对丰度是化验与管家正常化后18岁或者3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因和M0相比条件。每个基因的褶皱变化计算了2^-ΔΔCT并表示为平均值±标准偏差(SD)。

西方墨点法

细胞细胞溶解在radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(热费希尔)加上完成™蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏,印第安纳波利斯,美国)和phenylmethylsulfonylfluoride(1毫米,PMSF Sigma-Aldrich)。可溶性蛋白质变性在钠dodecylsulfate (SDS、2% Sigma-Aldrich)和β-mercaptoethanol (1%, Sigma-Aldrich),解决4到20% SDS-polyacrylamide凝胶电泳(SDS - page、BioRad大力神,CA)和转移到PVDF-FL膜(BioRad)。与5%的脱脂牛奶,阻塞后膜与抗体孵化TGFβ3 (Abcam) TGFβ1 (Abcam)和管家α-tubulin (Sigma-Aldrich),其次是特有的二级IRDye-labeled抗体(LI-COR生物科学、林肯、NE、美国)。染色信号被检测到并使用奥德赛数字化扫描仪(LI-COR)。特定的乐队TGFβ3密度测量和规范化的α-tubulin每个样本的相对表现。在重复实验。

免疫细胞化学

细胞培养无菌玻璃盖玻片neutral-buffered固定在2%多聚甲醛(EM科学,哈特菲尔德,妈,我们)在室温下为20分钟。冲洗样本permeabilized和阻止缓冲区包含3%正常山羊血清(热费希尔)和0.3% Triton x - 100 (Tx Sigma-Aldrich) 45分钟,其次是孵化与兔多克隆抗体对人类TGFβ3 (Abcam)或主机species-matched isotype-specific免疫球蛋白(Ig)一夜之间在4°C。洗后用PBS Tween-20 BSA为0.1%和0.1%,样本沾anti-rabbit Ig共轭AlexaFluor 488(热费希尔)和反核antigen-PE(藻红蛋白)共轭(Abcam)在黑暗中一个小时在室温下。洗后,盖玻片是安装Fluoromount-G®包含4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(热费希尔)和在共聚焦显微镜下观察(FluoView 1000年,奥林巴斯)。实验进行了一式三份。

小鼠角膜基质伤口模型和CSSC治疗

动物实验严格按照实验动物保健和使用指南的美国国立卫生研究院(NIH的贝塞斯达,医学博士,美国)和视觉和眼科学研究协会声明使用动物在眼科和视觉研究。机构批准的协议是匹兹堡大学动物保健和使用委员会(ISO00012511)。C57 / BL6老鼠(n= 20 /实验n= 60,一式三份)查尔斯河实验室运行,威尔明顿,美国),7 - 8周的年龄,被安置在一个AALAC-approved ABSL2设施,并提供一个无限制的标准饮食。他们被腹腔内氯胺酮麻醉(50毫克/公斤)和甲苯噻嗪(5毫克/公斤),和两只眼睛收到局部proparacaine盐酸(0.5%,Alcaine®,爱尔康,沃斯堡,TX,美国)。生理盐水冲洗后,中央角膜上皮(2毫米直径)去除掉使用Algerbrush II(莫尔文Accutome Inc ., PA,美国)和手术刀片# 15。前基底膜和基质组织进一步被AlgerBrush的第二个应用程序(17]。眼睛前清洗并简要干细胞治疗。受伤后,hCSSC 10⁴细胞/μl人类纤维蛋白原(70μg / ml, Sigma-Aldrich)和0.5μl凝血酶(100 U /毫升;Sigma-Aldrich)和应用于伤口。凝胶后,第二轮的纤维蛋白原和凝血酶应用于凝胶表面。眼睛受到局部庆大霉素(0.3%,Genoptic®, USP,罗克维尔市,医学博士,美国)和ketoprofen镇痛(3毫克/公斤)。我们精心设计了分组老鼠的眼睛损伤和细胞治疗,以便每个鼠标有一个功能对日常使用和生存。10在每组实验中,小鼠角膜受伤,成为虚假的控制处理中没有细胞;和其他角膜保持正常。10小鼠两眼角膜受伤与其中一个处理hCSSC(保留视觉报道)[9,10),和其他hCSSC-TGFβ3 (si)。实验在一式三份完成。

角膜瘢痕强度测量

14天post-wounding和细胞治疗,眼睛扫描光谱域光学相干地形(SDOCT) (Bioptigen、杜伦、钙、美国)。蒙面的方式分析了扫描图片关于治疗。图像处理和分析进行了使用ImageJ (NIH)和MetaMorph 7.7.3(分子设备Inc .,圣何塞、钙、美国)(10]。疤痕强度量化,像素强度从角膜地区获得ImageJ和平均背景强度减去。控制的眼睛是用于设置较低的阈值和每个鼠标和疤痕的强度总体均值和SD图形化显示。

小鼠角膜组织收集RNA表达分析

天post-wounding和治疗1、3、14日,老鼠牺牲。去核后,眼角膜被立即切除在冰上。每组4到6个眼角膜汇集在冰冷的RLT裂解缓冲(试剂盒)和中断与麦格纳赖氨酸绿珠工具包(罗氏)6000 rpm 50年代,在麦格纳赖氨酸仪器(罗氏),福特6周期,每个间歇冷却。溶菌产物是通过QIAshredder列和总RNA分离使用RNeasy Miniprep(试剂盒)制造商的指示。总RNA(0.5μg)转录cDNA上标三世(热费希尔)。基因表达与特定的引物或被qPCR化验TaqMan探测表中列出1。实验是在一式三份完成。

统计分析

所有数据被当作平均数±标准差。平均值相比,双尾t测试或方差分析与事后Bonferroni测试使用GraphPad棱镜7。使用非参数Mann-Whitney U角膜瘢痕强度比较测试。P< 0.05被认为是具有统计学意义。

人类CSSC表示TGFβ3 M1小鼠巨噬细胞的促炎症阶段

小鼠RAW264.7巨噬细胞的功能响应和稳定性(生)检测细胞因子刺激M1(促炎)和M2(消炎)条件。原始传播M0阶段(无花果。1a)治疗与有限合伙人和IFNγM1表型和显示一致的upregulation鼠标伊诺(诱导一氧化氮合酶)在不同的时间间隔(无花果。1b)。M1巨噬细胞分化,出现梭形、坚持文化的表面(图。1a)。IL4处理时,原始被保持为小,圆形的形态和调节鼠标__arg1(精氨酸酶1)表达(图。1a和b),表明M2表现型。相似的表达模式是在不同的研究报告(35,36]。hCSSC的培养与原始M1阶段已经展示了炎症反应细胞反应的表达升高TSG-6(无花果。1b)。在这促炎症状态,hTGFβ3显著调节(无花果。124 h c),从培养和持续增加直到实验结束(84 h)。这种感应没有M0和M2巨噬细胞阶段。另一方面,没有明显的变化hTGFβ1表达式在hCSSC M0、M1、M2条件。

疣状显示,TGFβ3 hCSSC表达时原始细胞培养在M1阶段(无花果。2a)。自从anti-TGFβ3抗体标记出现在老鼠的原始细胞(核和细胞质)(无花果。2d),特异性hCSSC是杰出的co-labelling HuNu(人类特定的核抗原)。在HuNu-labelled hCSSC, TGFβ3 M1促炎症条件下表达明显。TGFβ3信号在hCSSC位于细胞质扩散点状的模式与一些标签接近质膜(图。2在M2)。当原始细胞培养和M0阶段,hCSSC可忽视地表达TGFβ3(无花果。2b和c)。

M1巨噬细胞诱导hCSSC生产TGFβ3通过非接触式细胞间的沟通

在Transwell系统中,hCSSC和原始细胞放置在单独的房间。的原始细胞处理有限合伙人+ IFNγ诱导M1促炎症状态,hTGFβ3的表达在hCSSC 24小时后检测,显著调节在48小时8.2±0.1折,比未经处理的控制(无花果。3下)。没有生培养,hCSSC M1感应没有任何hTGFβ3变化。当比较这个Transwell M0下hCSSC与原始细胞的共培养,M1和M2条件36 h,我们观察到的一个重要upregulation hTGFβ3 hCSSC M1原始细胞的存在,但不是与M0和M2细胞(图。3b)。同样,TGFβ1表达式并没有改变在不同阶段(图。3b)。

抑制hTGFβ3表达hCSSC M1条件下核

Transwell设置,天真hCSSC(我),(2)hCSSC转染与hTGFβ3 siRNA [hCSSC - TGFβ3 (si)),或(3)hCSSC转染与炒序列被原始细胞M1条件下培养。48小时后,hCSSC-TGFβ3 (si)显示hTGFβ3表达减少,70 - 84%的天真hCSSC(无花果。4)。这是没有发现hCSSC转染与炒序列。hTGFβ1的表达并不影响hTGFβ3击倒(无花果。4b)。

hTGFβ3在鼠标调节基质hCSSC治疗后伤口

我们的体外模型显示hTGFβ3 upregulation在hCSSC促炎症状态。我们进一步探讨这个协会的体内模型角膜损伤和伤口愈合。人类CSSC被应用于纤维蛋白凝胶小鼠角膜基质消融的伤口。在天受伤和细胞治疗后1和3,hTGFβ3显著调节,相比hCSSC移植前(P< 0.05,单向方差分析)(无花果。5)。第一天的表达hTGFβ3增加了63±8折(图。5)和一个高256±63折叠在第三天(无花果。5与hCSSC-TGFβ3 b)。这种变化是微不足道的(si)治疗。相比之下,第一天hTGFβ1没有变化的表达式post-wounding和治疗(图。5在第三天),只有轻微的海拔(4±1.8折,而非移植hCSSC;无花果。5b)。在hTGFβ3 /β1比率方面,hCSSC治疗1和3天(图显示出类似的一系列值。5a和b)。平均比例在第一天是45,3天是65 (n= 5只老鼠每组损伤和损伤hCSSC治疗,分别)。

抗炎和anti-fibrotic hCSSC治疗对小鼠角膜基质的伤势的影响减少TGFβ3击倒

炎症在我们前面分析使用nanoString™鼠标和鼠标Pan-Cancer面板,大量的小鼠炎症基因受到hCSSC治疗(19]。我们检测早期炎症基因的RNA表达,包括CD80 C-X-C主题趋化因子配体5 (CXCL5) lipocalin 2 (Lcn2)、纤溶酶原激活物尿激酶受体(PLAUR) pro-platelet碱性蛋白(Ppbp)和磷蛋白质分泌1(Spp1)。这些基因在调节相比正常角膜受伤后第一天,和高表达显著抑制hCSSC治疗(图。6)。这种抗炎效应被废除的治疗hCSSC-TGFβ3 (si) (P< 0.05,单向方差分析)的基因表达水平相似,没有治疗受伤的眼角膜。

在第14天post-wounding和细胞治疗,消除疤痕效果hCSSC被废除时使用的治疗hCSSC-TGFβ3 (si)(图7)。brightfield照明的眼角膜,意味着伤疤强度(n= 6眼角膜每组)治疗后也显著大于hCSSC-TGFβ3 (si)相比,天真hCSSC (P= 0.008,Mann-Whitney U测试;无花果。7b)。鼠标纤维化基因的表达(Col3a1和αSMA)是由天真hCSSC显著抑制治疗(P< 0.05,成对的学生的学习任务),但仍然高企与hCSSC-TGFβ3 (si)(图7c)。这是同样观察到其他纤维化的基因,包括纤连蛋白(FN1),透明质酸合酶2(HAS2),分泌蛋白酸和半胱氨酸富有(SPARC),tenascin C(过渡委员会)(图。7d)。

在这项研究中,我们将描述小说的潜在机制hCSSC角膜基质角膜损伤后的再生。具体来说,我们的数据表明:(i) TGFβ3 hCSSC表达的调节在体外炎症环境;(2)hTGFβ3 hCSSC治疗后表达小鼠角膜基质的伤口,(iii)的具体击倒TGFβ3变弱这些抗炎和anti-fibrotic hCSSC体内的活动。这些研究结果加深了我们的理解CSSC抑制角膜治疗监管的阴霾和疤痕,和再生基质组织。

TGFβ3被hCSSC表达在体外和体内炎症环境。我们建立的培养系统hCSSC小鼠巨噬细胞相互作用(RAW264.7细胞)M0、M1和M2表型,模仿未提交,促炎和抗炎场景,分别在损伤和伤口愈合的过程。人类TGFβ3显著调节在hCSSC M1-type巨噬细胞的存在(促炎症)。共培养的感应检测在24小时之后和升级。也发现类似的结果当hCSSC被M1 Transwell系统中巨噬细胞培养,暗示的旁分泌作用扩散激活巨噬细胞的分子。因为微不足道的TGFβ3变化检测hCSSC单独接受IFNγ和有限合伙人时,相关的细胞因子诱导建议是专门的M1巨噬细胞,并可能从巨噬细胞分泌的分子。生产IL-1β和il - 6的激活巨噬细胞已被证明移植TGFβ3表达式在软骨细胞(37,38]。在这里,我们表明,CSSC可能采取类似的反应,激活巨噬细胞。进一步的研究将确定CSSC反应的分子机制在这个wound-associated促炎症状态。

使用一个体内小鼠角膜伤害模型,hTGFβ3 hCSSC治疗后表达也显著调节;有一个从第一天增加到3后处理(63折的意思是改变第一天增加到256折叠在第三天),在稍后的时间点(14天),治疗眼角膜是缺乏霾形成和保持清晰,类似于我们的先前的研究9,18]。这种治疗效果是暂停hCSSC治疗TGFβ3击倒。因此,抗炎和anti-fibrotic功能丢失,和受伤的眼角膜发达强烈的疤痕。TGFβ3生产的时机hCSSC伤口愈合早期阶段是类似于TSG-6表达式,也可以经过1天的hCSSC治疗新鲜基质伤口(18]。角膜创伤性炎症启动与中性粒细胞的浸润,其次是巨噬细胞。CSSC,显示MSC的特点,可以作为监护人对过度炎症反应通过多种机制如il - 1受体拮抗剂阻断il - 1的表达炎性信号TSG-6生产减少NF-κB信号常驻巨噬细胞而产生前列腺素E2诱导巨噬细胞il - 10的表达,以及钠歧化酶3的表达降低压制激进的氧物种的先天免疫(39]。其中,中性粒细胞浸润的阻塞是关键在创伤早期阶段控制炎症;然而,这一行动可能不是有效的抗纤维化hCSSC生产TSG-6仍然表现出纤维基因表达(18]。尽管我们的工作表明,CSSC函数通过TGFβ3信号控制纤维化发展是否协调或TGFβ3协同作用的过程和TSG-6在控制炎症和伤口愈合等待进一步调查。在目前研究角膜受伤,只有雌性老鼠被用来将他们受伤后不那么咄咄逼人,在社会住房,给可靠的结果。事实上,男女双方可以表现出类似的反应的角膜基质伤口愈合,疤痕形成和干细胞治疗结果连续研究(手稿提交)。

在人类基因组中,有33个功能基因编码TGFβ家庭多肽(40]。除了三个TGFβ亚型(β1β2和β3),家庭序列由骨形态发生蛋白(bmp),“生长和分化因素”(gdf),激活素、抑制素和节点的蛋白质(41]。的TGFβ亚型调节多种细胞过程开发和成年人通过基因调控通过Smad——和non-Smad-dependent通路42]。Smad-dependent信号的上下文中,这是更广泛研究,成熟和二聚的TGFβ配体信号通过绑定到细胞表面受体复合物结合两个I型和II型两个受体(TβRI和II),导致构象变化中的接口和受体激活(43,44]。Smad然后传达信号的受体蛋白质核调节目标基因表达(审查(42])。TGFβ亚型有多效性的函数在控制生理现象在胚胎发育期间,组织分化和专门化,炎症和免疫(29日]。的广泛行动概要TGFβ还发现在MSC的增殖和分化,ECM物质生产和趋化性影响不同细胞类型参与伤口愈合和相关的炎症反应(40]。

亚型,TGFβ1β2记录促进纤维化,从可见纤维母细胞转变和myofibroblast分化,诱导纤维化和瘢痕形成后伤害(45]。TGFβ3,另一方面,显示anti-fibrotic在皮肤、肺和肾脏模型(46,47,48]。在人类眼角膜受伤,增加TGFβ3水平相对于TGF-β1 /β2亚型与无疤痕相关表型(49,50]。TGFβ3长期存在的人类文化基质成纤维细胞导致non-fibrotic特征和沉积ECM像本机基质组织。TGFβ1治疗或β2相比,Col3的表达和αSMA被β3压制,而Col1合成是不变的。在另一项研究中,TGFβ3β1-treated成纤维细胞的纤维化基因表达降低,说明一个可能的“救援”效应除了纤维化发展预防措施(32]。在肌腱损伤模型中,添加TGFβ3 tenocytes调制Smad信号的表达下调Smad3及其磷酸化,抑制Smad4的核易位和减少fibrosis-related基因表达(51]。它还调节Smad7与TβR1互动,进而使其磷酸化,激活receptor-regulated Smad2/3,从而抑制TGFβ/ Smad信号。

为什么TGFβ亚型引起不同组织的反应仍然是一个谜。TGFβ1,β2β3有很高的序列同源性和分享大部分的细胞表面受体。配体结合后,受体磷酸化是重要的下游活动44]。可以被泛素及相关分子施加额外的控制。TβRs标记为polyubiquitination E3连接,通过招募Smad7 TβR1复杂,对蛋白酶体降解,因此导致不同的信号响应(52,53]。是否TGFβ3绑定TβR复杂刺激的特定受体类型退化导致基因表达发生变化仍有待确定。此外,大多数受体受共受体配体的演讲,这是跨膜蛋白或膜蛋白锚定glycophosphoinositol。他们还调解被其他细胞因子受体信号,给大集成的影响不同的细胞信号转导和病理生理条件。积极TGFβ1和β3肽结合TβRII /我复杂的高亲和力,而β2与这种受体受体TβRIII的存在,一个细胞表面β-glycan [54]。相声和微分调节受体活动是否有助于进一步阐明不同的细胞因子的行为是重要的话题。

hCSSC提供抗炎和通过TGFβ3 anti-fibrotic影响生产,支持工业的作用作为一个治疗角膜修复和再生剂。没有任何已知的有害影响,外生TGFβ3可以应用于伤口部位刺激无疤痕组织反应;然而,CSSC可以连续生产TGFβ3生理相关的水平。因此,使用本地细胞再生的承诺无疤痕的角膜基质为角膜疾病恢复视力。

数据可从相应的作者在合理的请求。

__arg1:

精氨酸酶1

Col3a1:

胶原蛋白3 a1

的边后卫:

胎牛血清

hCSSC:

人类角膜基质干细胞

HuNu:

人类特定的核抗原

il - 4:

Interleukin-4

伊诺:

诱导一氧化氮合酶

有限合伙人:

脂多糖

mRAW:

小鼠RAW264.7巨噬细胞

硕士:

间充质干细胞

TGF:

转化生长因子

过渡委员会:

Tenascin C

TNFα:

肿瘤坏死factor-α

TSG-6:

肿瘤坏死factor-stimulated基因6

αSMA:

α-smooth肌肉肌动蛋白

核:

小干扰RNA

我们感谢k Davoli组织学处理角膜样品和k·莱斯罗普,博士的观点,对显微镜培训。

这项工作是由美国国防部授予w81wh - 19 - 1 - 0778 (JLF码),国家卫生研究院的基金RO1 EY016415 (JLF)和e EY008098 (JLF),斯坦创新者奖从研究防止失明(JLF),眼睛和耳朵匹兹堡的基础,和路易J福克斯中心视力恢复。

作者指出

1. 詹姆斯l . Funderburgh死亡。

从属关系

1. 匹兹堡大学医学院眼科学系,203年得街,匹兹堡,PA, 15213年,美国

   林翁,詹姆斯l . Funderburgh Irona Khandaker,莫伊拉l . Geary甜饼杨,罗翰巴苏,玛莎l . Funderburgh Yiqin Du &加里Hin-Fai山药

2. 上海兰和验光和眼科诊所,上海,200032年,中华人民共和国

   林翁

贡献

LW JLF:概念和设计;LW,反向,MG,泰,RB, MLF:收集和汇编的数据;码,LW, JLF GY:数据分析;JLF码:金融支持;LW, JLF码,GY:手稿写作。所有作者批准了手稿。

相应的作者

对应到加里Hin-Fai山药。

伦理批准和同意参与

本研究遵循赫尔辛基宣言》的原则规定和批准,匹兹堡大学的机构审查委员会和监督委员会的研究和临床培训涉及死者们(CORID协议# 161)。动物实验与协议批准机构动物保健和使用委员会,匹兹堡大学(ISO00012511)。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

没有任何金融和非金融的相互竞争的利益存在。

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