米的至关重要的作用⁶甲基化在坟墓的眼病的发病机制

目的

调查N6-methyladenosine (m的角色⁶)RNA修改在坟墓的眼病的发病机制(去)。

方法

手术切除患者眼外肌肉从7和5科目没有去。全球人口⁶标本的水平决定使用一个m⁶核糖核酸甲基化量化工具。RNA序列(RNA-seq)是用于分析所涉及的分子的规定⁶信使RNA的RNA甲基化和微分表达式之间的两组(分别为4的眼睛)。米的表达⁶RNA修改基因被实时PCR评估。之间的基因改变的功能影响和控制标本测定基因本体分析。

结果

m⁶水平明显增加去病人的标本相比,控制样本(P< 0.05)。米的表达⁶甲基化监管机构,如相关WT1蛋白(WTAP)、烷基化修复同族体蛋白5 (ALKBH5) E74像ETS转录因子3 (ELF3) YTH N6-methyladenosine RNA结合蛋白2 (YTHDF2) YTHDF3从技术上说,云天化域包含2 (YTHDC2)显著调节(P< 0.05)。基因本体富集分析表明,最高度调节基因和生物通路相关的免疫反应和炎症过程,如淋巴细胞激活,白细胞分化、细胞因子的生产和cytokine-mediated信号通路。

结论

我们的研究结果表明,m⁶甲基化可能发挥重要作用的发病机理,针对基因调节m⁶甲基化可能提供一种新的治疗方法。

Graves眼病(去),也称为甲状腺眼病(TED),最重要的是extrathyroidal表现坟墓的疾病患者。临床表现的结果主要来自轨道内的免疫和炎症反应。病理过程被公认为是由细胞和体液免疫和炎症,刺激retroocular纤维母细胞增生,局部脂肪形成和眼外肌的炎症反应(加工)和间质组织。可能导致损害的眼部能动性和盖子收缩,接触角膜病、视神经压缩,甚至视力丧失(1]。虽然是被广泛接受的是一种自身免疫性的过程,其发病的确切机制仍在调查之中。

越来越多的证据表明,表观遗传因素可能参与甲状腺肿的发病机制(GD)。先前的研究显示异常的DNA甲基化在GD患者中,和全基因组DNA甲基化分析确定132 hyper-methylated和133 hypo-methylated地区GD患者(2]。除了异常的DNA甲基化、组蛋白修饰的变化也从GD患者外周血单核细胞中发现的。表观遗传因素的想法GD的发病机制是进一步支持报告显示全球异常组蛋白甲基化和组蛋白脱乙酰作用GD患者(2,3]。这些结果表明,表观遗传修饰导致GD和去的发病机理;然而,RNA的参与甲基化在GD组件的发病机理,特别是去,还没有被报道。

核糖核酸甲基化是一个重要的信使RNA转录后修饰事件,和N6-methyladenosine (m⁶)是最普遍和丰富的真核mRNA修改(4]。米⁶生成一个转录由m⁶甲基转移酶复杂(m⁶一个“作家”)。这个作家复杂包括methyltransferase-like 3 (METTL3), methyltransferase-like 14 (METTL14), WT1蛋白(WTAP)有关,梵像m6A甲基转移酶(VIRMA)和RNA结合主题相关蛋白质15 (RBM15)。删除的甲基腺苷基地nitrogen-6位置由酶被称为m⁶“橡皮擦”。FTO alpha-ketoglutarate依赖加双氧酶(FTO)和烷基化修复同族体蛋白5 (ALKBH5)是两个确定m⁶一个橡皮擦。蛋白质可以识别并结合m⁶一个被称为“读者”。从技术上说,云天化域蛋白家族成员作为读者,绑定YT521-B同源域(例如,YTHDF1-3和YTHDC1-2) (5]。

最近,新兴的证据表明,m⁶扮演至关重要的角色在许多病理过程,包括肿瘤发生,血管生成,组织变性和,重要的是,自身免疫和炎症反应6,7]。米⁶甲基化被报道与NF-κB和MAPK激活和炎症反应8,9]。此外,没有米⁶由METTL3, CD4 +和调节性T细胞丢失之间的平衡(7,10]。沉默METTL3抑制炎性细胞因子(即。,IL-6) production and the major inflammatory signaling pathways [11]。集体,公布的数据表明,免疫和炎症反应的严格监管⁶甲基化。然而,米⁶甲基化状态及其潜在的发病机制尚不清楚。在这里,我们分析了m的水平⁶从手术切除加工及其相关分子的病人和外斜视患者(对照组)和基因本体分析用于评估功能性浓缩这些水平的相关性。据我们所知,这份报告是第一个调查是否m⁶RNA的甲基化改变在标本上的病人。

收集加工

病人和控制对象是从北京大学人民医院的眼科学系(中国,北京)。这项研究是诊所的机构审查委员会批准北京大学人民医院(2019 phb312-01)和符合《赫尔辛基宣言》。书面知情同意了所有病人之前报名。被诊断为基于GD的历史(由轨道专家在北京大学人民医院)。参加研究的患者有中度到重度的突出以赫特尔exophthalmometer和计算机断层扫描(CT)扫描证实的轨道。所有的病人在euthyroid状态至少3个月,没有处理轨道放疗。病人的临床特点及其治疗如表所示1。所有的手术都由眼科专家。加工标本,加工和相关的最厚区域压缩视神经,收集在轨道减压手术;控制标本从接受手术的患者获得正确的共同性外斜视。大多数被用于临床标本组织学分析,一些人沉浸在RNAlater稳定的解决方案和快速冻结在−80°C的研究目的。

米⁶一个RNA量化

总RNA分离加工使用试剂盒试剂(生活表达载体技术有限公司,卡尔斯巴德、钙、美国)。一个EpiQuik™米⁶核糖核酸甲基化量化工具包(美国纽约比色,Epigentek组)被用来测量m⁶内容的总RNA样本根据制造商的指示。总之,分析井被涂上一层200 ng的RNA。捕获和检测抗体分别添加到试验井。m⁶一个水平量化colorimetrically通过阅读每一个在一个波长的吸光度450海里(SpectraMax®190标,分子器件、LLC),和m⁶基于该标准的内容然后计算曲线。

转录组测序的图书馆建设

测序图书馆构建使用NEBNext®超™RNA从Illumina公司图书馆准备工具®(美国内)后,制造商的指示。指数代码添加到属性为每个样本序列。

读到参考基因组的映射

参考基因组和基因模型直接从基因组注释文件下载网站。参考基因组的索引使用Hisat2 (v2.0.5)和paired-end清洁读取使用Hisat2对齐到参考基因组。我们选择Hisat2作为映射工具因为Hisat2可以生成一个数据库基于注释的基因模型的拼接连接文件,因此可以提供更好的比其他non-splice映射映射工具。

量化的基因表达

功能项v1.5.0-p3被用来计算读取映射到每个基因的数量。的同时考虑基因测序深度和长度对读计数,每百万映射读取每千碱基的片段(FPKM)值是目前最常用的参数估计基因表达水平。因此,每个基因的FPKM值计算是基于基因的长度和读取映射到基因的数量。

差异表达分析

差异基因表达分析两组都使用了DESeq2 R包。DESeq2提供统计程序确定微分表达式在数字基因表达数据使用一个模型基于负二项分布(12]。由此产生的P值调整使用Benjamini和业务控制错误发现率的方法。基因的调整假定值小于0.05被DESeq2被认为是差异表达。

聚类和排序

index-coded样本的聚类是在芝加哥期货交易所执行集群生成系统使用TruSeq PE集群装备(v3-cBot-HS Illumina公司)根据制造商的指示。集群生成后,图书馆是测序的Illumina公司NovaSeq平台,和150 - bp paired-end读取生成。

基因个体发生学分析

基因个体发生学分析应用于探索可能通过Metascape差异表达基因的生物学功能。重大丰富本体术语和通路被确定使用确切概率法。

差异表达的验证由RT-qPCR mrna

验证RNA-seq分析结果、RT-qPCR被用来验证选择12 mrna的表达水平在一个额外的4例。总RNA提取加工如上所述,然后反向转录使用ReverTra Ace®qPCR RT工具包(Toyobo、日本)根据制造商的指示。选中的mrna的相对表达水平测定使用SYBR绿色®实时PCR反应混合液(Toyobo、日本)。使用2相对基因表达水平进行了计算^{——∆∆CT}方法。GAPDH是用作内部控制。所有实验一式三份,三次重复。引物序列表中列出2。

统计分析

数据给出平均值±标准偏差(SD)。两组之间的差异进行了分析使用的小动物——一张长有学生的学习任务。统计学意义的标准P< 0.05。

增加水平的米⁶在去病人

探索m的潜在作用⁶修改的发病机理,我们加工的总RNA提取7病人和对照组5然后测量全球m⁶水平的总RNA样本。使用比色米⁶量化策略,我们发现m⁶水平显著增加的组织与控制组织(P= 0.03539)(图1一个)。

然后,我们假设异常⁶去修改水平是由失调的关键⁶甲基转移酶和demethylases及其结合蛋白(m⁶甲基化的读者)。为了测试我们的假设,我们使用RNA序列(RNA-seq)来衡量这些基因的表达水平在4双加工去对照组患者。WTAP显著调节与控制加工(相比,去加工P< 0.05,无花果。1b)。相比之下,在FTO的表达无显著差异,观察ALKBH5之间加工从患者和对照组。有趣的是,三米⁶readers-ELF3, YTHDF2和YTHDC2-were显著增加加工与控制加工(P< 0.05)。转录组测序结果验证,我们使用RT-qPCR检查12组件的表达与m⁶RNA修改(无花果。1c)。大多数的PCR结果与RNA-seq结果一致,表明WTAP, YHDF2 YTHDC2但不是ALKBH5和HNRNPA2B1显著调节标本。

患者和对照组之间差异表达mrna

测量后的表达⁶修改基因,我们分析了所有基因的转录组的四个病人标本去和四个标本对照。火山生成图来说明mrna表达的不同的两组。意义阈值设置为2.0 >的褶皱变化和调整P< 0.05。在4393 mrna确认,1374是调节和1508年下调(与控制,无花果。2的热图)。分层聚类分析结果显示两组之间的区分mrna的表达模式(无花果。2b)。这些数据表明,mrna的表达显著改变的结果。

基因和通路富集分析

基因富集分析识别差异表达mrna的浓缩和基因产物在生物过程中,细胞组件和分子功能。大部分的调节mrna参与各种免疫和炎症过程,如淋巴细胞激活、白细胞分化、细胞因子生产、cytokine-mediated信号通路和适应性免疫反应。相反的,相关的差异表达基因表达下调主要组织形态发生,感觉器官的发展,胚胎形态发生和细胞外基质(无花果。3)。此外,路径分析是识别相关的生物学途径进行差异表达mrna。基因和基因组的京都百科全书(KEGG)分析结果表明,75通路识别研究中两组之间显著不同(P< 0.01)。与基因富集分析结果一致,通路参与免疫和炎症反应,如cytokine-cytokine交互,NF-κB信号、细胞受体信号,toll样受体信号和肿瘤坏死因子信号,调节基因中最高纯度(无花果。4)。

表达式的炎症和免疫与响应相关的细胞因子

大部分的调节基因和信号通路与炎症和免疫反应有关。因此,特定细胞因子的基因表达水平测定。il - 6表达表现出最大的增加;这是调节超过100倍的患者与对照组相比。此外,其他炎性细胞因子的表达水平,如地震、IL-1B, il - 10, TNF, interferon-γ(IFN-γ)和IL-17B,增加相对于对照组的2倍多,P值小于0.001(表3)。

走是一种慢性炎性疾病轨道组织不仅影响轨道的脂肪组织,成纤维细胞和其他结缔组织也加工。可以看到加工扩大患者去与疾病进展密切相关。重要的是,自身抗体针对加工抗原已发现在患者(13,14),强烈建议加工可能是一个主要目标的自身免疫反应。大多数以前的研究集中于轨道脂肪组织的作用和成纤维细胞的形成;只有少数研究显示加工的一般作用的发病机理,和这些研究报告加工异常的表观遗传因素的相关性。在目前的研究中,我们试图探讨m的角色⁶甲基化的发病机理中去使用手术切除加工。

米⁶一种RNA甲基化影响各种生物过程,特别是转译后的修改和异常RNA甲基化与病理条件下,如老化(15),免疫反应,低氧应激反应(16),肿瘤发生、神经退化和感染。然而,米的作用⁶RNA修改的发病机理尚未被证实。在这项研究中,我们发现,m⁶加工的RNA甲基化水平显著增加患者与对照组相比,表明细胞m的丧失⁶加工的体内平衡,可能是因为炎症微环境。事实上,我们表明,组件参与m6A RNA的表达修改,如m6A RNA WTAP甲基化作家和读者YTHDF2 YTHDC2和ELF3显著调节。我们的研究结果表明,m⁶一个RNA甲基化可能是一个重要的中介去发病机理。

炎症的轨道去接受是由于患者自身免疫反应和炎性细胞因子释放17,18]。核糖核酸甲基化报道调节t细胞内稳态和针对炎症通路的炎症反应19]。因为我们发现改变全球m⁶核糖核酸甲基化和m的活动的增加⁶甲基化酶复杂,demethylases和m⁶读者去病人的标本,我们试图确定是否存在潜在的异常之间的关系⁶核糖核酸甲基化和炎症相关的基因的高表达和活动相关的通路。因此,RNA-seq分析,我们的结果表明,最多的基因表达明显增加去那些与炎症反应有关。如无花果所示。2景观,转录组的数据加工的患者去证明4393 mrna的识别,1047被调节和1508年相比,去组织表达下调来控制组织。层次聚类分析表明之间的基因表达模式的差异去的对照组。富集分析应用于更进一步验证获得的数据从转录组分析以确定标本被浓缩在炎症基因。我们证明了十大调节mrna功能参与免疫和炎症反应,指淋巴细胞激活,白细胞分化、细胞因子生产、cytokine-mediated信号通路和适应性免疫反应。相比之下,大多数的表达下调基因与细胞外基质(ECM)的生产和组织发展。炎症反应的重要性在发病机理是更进一步支持特定炎性细胞因子基因的表达分析。如表3表明,il - 1的表达,il - 6,引发,il - 10, IL-17, IFN-γ,TNF-α显著调节加工从病人。细胞因子il - 6等IFN-γ和TNF-α之前报道促进成纤维细胞增殖和分化在去17]。更重要的是,我们发现通过KEGG分析19通路的生物通路12参与免疫和炎症反应。总的来说,这些结果表明,炎症的发病的主要病理事件。

在蛋白质调节m⁶核糖核酸甲基化,WTAP似乎是必不可少的调节亚基米⁶甲基转移酶的活动。在分析m⁶调控蛋白,实时PCR和RNA-seq WTAP基因分析表明,加工的显著高表达患者比对照组。WTAP表达的增加被认为是各种疾病的危险因素(20.]。功能,WTAP可能参与众多信号通路的激活,如表皮生长因子信号(21)、mTOR通路和Wnt信号(22),这些信号通路参与炎症反应,暗示WTAP可能去发病的一个重要中介。

除了WTAP外,其他组件与m⁶RNA中确定甲基化我们的研究从技术上说,云天化域家庭成员(YTHDFs)和ELF3;YTHDF1/2的水平和ELF3显著增加患者的加工。此外,另一个水平⁶结合蛋白,hnRNP家族蛋白质HNRNPA2B1,非常高的加工标本去病人。m⁶加工的结合蛋白检测标本可能参与调节炎症过程,针对炎症基因的mRNA转录稳定(13]。先前的研究显示,YTHDF2起着重要的作用在调节炎症通过NF-κB的调制信号通路(23]。值得注意的是,我们发现在19日确定通路,12人与炎症有关。这些数据表明YTHDFs之间的密切关系和NF-κB信号通路调节炎症反应的发病机制。

有趣的是,我们发现控制炎症基因的表达及其相关信号通路相关基因编码细胞外基质的差别,对这些标本的加工。我们的结果与最近的出版物,表明表达的一些关键ECM组件(如胶原蛋白1 a1,胶原蛋白1 a2,胶原蛋白2 a1抑制在加工标本去病人虽然从蛋白质分析结果24]。另一方面,增加细胞外基质基因的表达去病人的标本在早些时候报告(25,26,27]。ECM的基因表达差异的一些以往的研究,我们可能归因于以下几点:(1)方法用于分析基因表达是不同的。在我们的研究中,RNA-seq,整个转录组高通量分析,是用来研究基因表达。它的价值被广为记载在基因表达和功能的研究。然而,在其他报告,PCR或评估微阵列应用特定的标本的基因表达,从而重点和基线是不一样的。因此,不同的方法应用于独立研究的变量可能导致的结果。(2)我们的标本收集加工的最厚区域一致,他们准确地代表的病理状态。然而,在此前的许多出版物,研究获得的标本的面积ECM表达式没有定义[17,24,28]。因为基因表达可能变量去标本的肌腱和肌肉组成部分(29日),这个因素可能会影响ECM基因的表达。(3)不同的结果可能是由于样本来自不同的状态:一个活跃的炎症状态(炎性细胞因子的生产)或一个静态状态(结缔组织增长和ECM沉积)30.]。主导炎症的病理过程积极去(31日]。炎性因子TNF、il - 1、il - 6引发更高的标本的活跃状态比稳定的状态。Hiromatsu表明TNF的表达增加在加工成比例增大加工(28]。同时,变量积累细胞外基质取决于基质金属蛋白酶的酶可以降解ECM;基质金属蛋白酶水平的增加被认为在不活跃的阶段的患者(32]。重要的是,炎性细胞因子可以移植基质金属蛋白酶,包括轨道成纤维细胞的细胞33,34,35]。在我们的研究中,炎症基因的表达特别是il - 6,地震和肿瘤坏死因子(见表3)及其信号通路控制事件,这意味着一个活跃的状态。因此,这可能是原因之一,更少的ECM-related基因被认为在我们的研究中。(4)m的放松管制⁶一个甲基化可能与ECM的差别,对这些标本。在这项研究中,增加m⁶甲基化是ECM的差别与对这些标本,是符合于等人的研究表明,增加m⁶甲基化可能导致胶原蛋白的表达的减少ECM(这是一个主要组成部分36]。我们发现的显著增强成绩单WTAP(如组件的哺乳动物m6A甲基转移酶复杂)的ECM基因的差别与对这些标本。总的来说,这似乎是可信的ECM基因的表达去标本可能是由RNA甲基化(36,37,38]。事实上,WTAP可能特别有助于减少ECM基因的表达(37,39]。当然,需要进一步的研究来证实这一发现。

总之,我们的研究表明,m⁶内容在去病人明显增加,确定监管机构m6A甲基化的异常表达。重要的是,我们表明,大部分的调节基因和生物通路在标本患者相关的免疫反应和炎症过程。我们的研究提供了新的见解的发病机制去表明针对m⁶甲基化可能是一个潜在的治疗方法。

的数据支持本研究的结果可在合理的请求从相应的作者。

不适用。

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(批准号81770943和81770943),北京市科学技术委员会(资本Char——acteristic临床应用研究项目,Z161100000516037)。

作者指出

1. 李朱和李Siyan贡献同样本文co-first作者。

从属关系

1. 眼科学系、北京大学人民医院眼科疾病和验光研究所北京重点实验室视网膜和脉络膜的疾病的诊断和治疗,验光学院北京大学健康科学中心,西直门南大街11号Xi程区,北京,100044年,中国

   李Siyan,李朱,他使坤,Qizhe通,Lejin Wang Xi,孟教授,Enzhong金,栓,天元Li Ningda Xu Lvzhen黄,易王& Mingwei赵

2. 河南省人民医院和河南的眼科医院,郑州,中国

   小华李

贡献

MWZ和YW共同通讯作者,导致项目的设计和修订手稿。LZ和西尔维co-first作者,导致数据分析,解释和起草了手稿。SKH回顾和修订后的手稿。QZT、LJW XHL, XW QYM,开盘后,CZ, TYL, NDX, LZH导致标本收集和手稿的讨论。所有作者阅读和批准最终的手稿。

相应的作者

对应到易王或Mingwei赵。

伦理批准和同意参与

北京大学人民医院伦理委员会批准了这项研究协议(2019 phb312-01)。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

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