通过减少VEGF-A在糖尿病视网膜病变中可防止抗VEGF治疗可防止Müller细胞内水肿

背景

虽然已知血管内皮生长因子A（VEGF-A）在导致视网膜水肿中发挥关键作用，但VEGF-A如何诱导视网膜中的细胞内水肿仍然尚不清楚。

方法

用链脲佐菌素腹腔注射致糖尿病大鼠。糖尿病发病8周后进行玻璃体腔注射雷尼比单抗。用乙二醛处理rMC-1细胞(大鼠Müller细胞系)24小时，用雷尼单抗或不用雷尼单抗。内整型K的表达水平⁺4.1通道(Kir4.1)、水通道蛋白4 (AQP4)、营养不良蛋白71 (Dp71)、VEGF-A、谷氨酰胺合成酶(GS)和钠钾atp酶(Na⁺- k⁺- atp酶)，Western blot检测。ELISA检测细胞培养上清中VEGF-A的含量。用特异性指标检测细胞内钾、钠水平。

结果

与正常对照相比，Kir4.1和AQP4的蛋白质表达在糖尿病大鼠视网膜中显着下调，由Ranibizumab预防。以上变化在体外重新核发。类似地，糖类处理的RMC-1细胞的细胞内钾水平增加，而细胞内钠水平和NA⁺- k⁺- atp酶蛋白水平保持不变。然而，雷尼单抗治疗降低了细胞内钠，但没有降低钾。

结论

Ranibizumab通过直接结合VEGF-A，上调Kir4.1和AQP4，保护Müller细胞免受糖尿病细胞内水肿。它还引起细胞内渗透压的降低。

糖尿病性视网膜病变(DR)是工龄人群致盲的主要原因，其中糖尿病性黄斑水肿(DME)是DR最常见的并发症。^1那2视网膜水肿由Starling方程驱动，是由于液体进入、流出和视网膜液压传导不平衡，导致视网膜内或视网膜下液体积聚。在生理条件下，血-视网膜屏障(BRB)的完整性和Müller细胞和视网膜色素上皮(RPE)的正常功能调节离子和水的流入和流出。^3.然而，在DME中，液体进入增加和引流功能下降导致细胞内和细胞外水肿。内部BRB的破坏起着最重要的作用，它是由连接复合物的交替引起的，^4.增强的造细胞渗透性，^5.内皮细胞的丧失，^6.周细胞丢失^7.血管异常。^8.那9.Müller胶质细胞和RPE的功能障碍也有助于神经视网膜和视网膜下间隙中的液体积聚，导致细胞内和细胞外水肿。¹⁰在我们之前的研究中发现，在较严重的DME (CSFT > 275 μm)中，中央亚野厚度(CSFT)与内核层厚度(INLT)之间存在较强的相关性，提示细胞内水肿，特别是Müller胶质水肿有助于DME的形成。¹¹Müller细胞作为视网膜的特异性大胶质细胞，主要通过向内整流钾通道4.1 (Kir4.1)和水通道蛋白4 (AQP4)来调节离子和水的稳态。^12那13那14Müller细胞也是血管内皮细胞以外的血管内皮生长因子(VEGF)的主要来源。¹⁵

Kir4.1的极化分布使钾离子流出神经视网膜。¹³水通过AQP4进行转运，AQP4是与Kir4.1共同定位的一种选择性水转运蛋白。Kir4.1和AQP4均被Dystrophin 71 (Dp71)固定在Müller细胞的细胞膜上。^16那17有报道称，在视网膜静脉阻塞和缺血再灌注损伤等多种疾病模型中，Müller细胞肿胀是由于Kir4.1、AQP4和Dp71的下调或再分配引起的。^18那19

由于VEGF作为DME发病机制中的关键介体，玻璃体内抗VEGF治疗已成为治疗DME的护理标准。在患有DR的患者中，据信通过溶胀和染色的Müller细胞形成囊拓DME。^20.在我们的临床实践中，光学相干断层造影血管造影（OCT-A）在DME患者中显示出囊性水肿和B扫描视图（图。1a)，突出Müller细胞内水肿。^20.玻璃体内注射抗vegf 1周后，随着囊样数目和大小的减少，囊样水肿明显减轻(图1)。1b），暗示抗VEGF治疗对Müller细胞内水肿的减少的潜在影响，除了其对非细胞水肿还原的经典作用。然而，用于抗VEGF效应的可能机制仍然是未知的，例如，仍然未知。抗VEGF治疗是否可以直接影响糖尿病视网膜中Müller细胞中Kir4.1，AQP4和DP71的表达水平或分布。因此，在本研究中，我们旨在探讨Ranibizumab在实验博士中保护Müller细胞免受细胞内水肿的可能机制。

试剂和抗体

针对Kir4.1（APC-035）和AQP4（AQP-004）的主要抗体来自Alodone Lab（耶路撒冷，以色列）。营养不良蛋白（AB7164），GFAP（AB53554）和NA⁺- k⁺-AtPase（AB76020）抗体来自Abcam（剑桥，英国）。谷氨酰胺合成酶（GS，NBP2-43646）和VEGF-A（NB100-664）抗体来自Novus生物（Littleton，USA）。钾指示剂（P1267MP）和钠指示器（S1263）来自Thermo Fisher Scientific（中国上海）。

实验动物和玻璃体腔注射雷尼单抗

根据ARVO眼科和视力研究使用动物声明和动物护理和使用指南(国家研究委员会和同济大学)对动物进行治疗。本方案经同济大学动物实验伦理委员会批准(许可证号:TJHBLAC-2020-06)。六十雄性Sprague-Dawley大鼠重量120g至150克（Slaccas，上海，中国）分为三组：正常对照（n），糖尿病大鼠（d），糖尿病大鼠含有含有玻璃体植物ranibizumab（d + r）。通过腹膜内注射STZ（60mg / kg体重，溶解在柠檬酸盐缓冲液，pH 4.5）中诱导糖尿病，对照大鼠接受相等体积的柠檬酸盐缓冲液。血糖水平超过300mg / dl连续3天的大鼠被认为是糖尿病大鼠并包括在本研究中。在糖尿病发作后8周在糖尿病大鼠中进行玻璃体内注射。Ranibizumab（2μl中的20μg/眼睛）通过30·仪表，0.5英寸的针（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA），用30-Cauge（汉密尔顿，雷诺，NV，USA）注入静脉内（汉密尔顿对于正常和糖尿病对照，注射了相同体积的生理盐水（2μL）的正常盐水。注射后四周，处死大鼠，并对以下研究进行眼睛。

大鼠Müller细胞(rMC-1)培养

转化的大鼠视网膜Müller细胞系（RMC-1）由Sarthy（西北大学，芝加哥，IL，USA）提供。在37°C的含有10％胎牛血清（Gibco，上海，中国）和1％青霉素/链霉素的低葡萄糖（5.5mm）DMEM中培养细胞。₂在潮湿的培养箱中。的CE.lls were divided into three groups, i.e., normal control (N), glyoxal (1 mM)-treated group (G), and glyoxal (1 mM) + ranibizumab (0.125 mg/mL)-treated group (G + R).

细胞生存能力分析

采用细胞计数试剂盒-8 (Cell count Kit-8, CCK-8)检测rMC-1细胞活力。简单地说，rMC-1细胞，用不同剂量的乙二醛(0.1至5 mM)孵育，以10的密度将细胞接种在96孔板上^4.使用或不使用雷尼单抗(0.125 mg/mL)处理细胞1h至36 h，然后与含有10% CCK-8的DMEM在37°C下孵育3 h。在450nm处用微孔板分光光度计(Tecan, Crailsheim, Germany)测定吸光度。细胞存活率以未处理对照组的百分比表示，每次实验均定义为100%。

RNA提取和实时PCR

从RMC-1细胞中提取总RNA。进行逆转录，使用SYBR绿色实时PCR主混合物（云博，大阪，日本）进行实时PCR。底漆信息列于表中1．

免疫印迹

在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上溶解等量的蛋白质并将电泳在硝酸纤维素膜（Bio-Rad，Shanghai，China）上转移。将膜在室温下在室温下在5％TRIS缓冲盐水补肾-20（TBST）缓冲牛血清白蛋白中封闭30分钟，然后用针对KIR4.1（1：500），AQP4（1：1000）的抗体分开孵育，Dystophin 71（1：1000），GS（1：1000），GFAP（1：1000），VEGF-A（1：1000），NA⁺- k⁺-ATPase(1:10 000)或β-actin(1:20 00)，在4°C过夜，并与相应的二抗(1:10 000)在室温下作用1小时。通过化学发光或奥德赛红外成像系统(LICOR Biosciences, Lincoln, NE, USA)对膜进行可视化。各条带的光密度用Quantity One软件(Bio-Rad)测定，蛋白质的密度值用β-actin归一化。

Müller细胞内水肿的半薄切片评价

按已发表的方法对视网膜Müller细胞在体细胞内水肿进行评价。²¹简单地说，将大鼠处死，眼球摘除并在2.5%戊二醛中固定30分钟 在解剖显微镜下对眼睛进行解剖，取下眼睛前部。将眼睛后部固定在2.5%戊二醛中5小时以上，然后以分级酒精系列（50、70、95和100%）脱水半薄切片制样时，将视网膜切成约2.25的小块 嗯²．半薄切片(1 μm)用德国莱卡EM UC7切片机切割，甲苯胺蓝染色。光镜下观察肿胀的Müller细胞形态(Tecnai G2 20 TWIN, FEI, USA)。为了定量，Müller细胞内水肿被计算为每200 μm视网膜的带状间隙的数量。

免疫荧光

用4% pbs缓冲多聚甲醛在4°C下过夜固定大鼠眼睛。在解剖显微镜下切除眼球前段。其余眼杯在30%蔗糖溶液中脱水2 d，然后包埋在最佳切割温度化合物(OCT;Sakura Finetek Japan Co.， Ltd.， Tokyo, Japan)为节。切片(15 μm厚)在1% BSA和0.05% Triton X-100缓冲的PBS中渗透并封闭1小时。然后将切片与一抗在4°C下孵育过夜，并与相应的二抗在室温下孵育1小时。用4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育2 min后，用盖玻片固定。用徕卡显微镜(德国DMI3000)观察载玻片。不同组在每次实验中同一通道的暴露条件是一致的。

使用图像J（http://imagej.nih.gov/ij/;由美国国家卫生研究院(Bethesda, MD)公开提供)，并表示为每单位长度视网膜的荧光积分光密度(OD)。使用矩形选择工具选择要量化的定义区域。通过设置一个合适的阈值来调节荧光信号，该阈值对所有图像都适用。

ELISA

收集rMC-1细胞上清，在−80℃下保存至检测。上清中VEGF-A浓度按照说明书用ELISA试剂盒检测。VEGF-A浓度由标准曲线计算，并以总蛋白浓度归一化，表示为每微克总蛋白纳克(ng/mg总蛋白)。

测定细胞内钠和钾水平

采用SBFI AM(钠)、PBFI AM(钾)检测细胞内钠、钾浓度。原液(1mm)在DMSO中重组，在−20℃的黑暗中存储。首先将rMC-1细胞接种在96孔板上，用乙二醛(1 mM)加或不加雷尼单抗(0.125 mg/mL)处理24小时。用SBFI AM或PBFI AM(稀释至最终浓度10 μM) 37℃孵育细胞3 h。用平板阅读器测量荧光(激发= 340 nm，发射= 500 nm)。荧光强度按细胞数量归一化。

统计分析

结果以平均值±SE表示。采用SPSS软件22.0版(IBM公司，Armonk, NY, USA)进行统计分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnett’s检验。的P.0.05或更小的值被认为具有统计学意义。

Müller糖尿病大鼠视网膜细胞内水肿加重，雷尼单抗缓解

为了评价Müller在体内的细胞内水肿，我们采用了已发表的方法，用视网膜的半薄切片。²¹如图1所示。2与正常对照组相比，在外核层（ONL）的核之间以带状透明间隙之间检测流体积聚，显示Müller细胞的溶胀的顶端过程或其围绕细胞外空间的延长。在Ranibizumab治疗后，减轻了Müller细胞的细胞内水肿（图。2一种）。如图1所示。2b、 正常对照视网膜的ONL中未发现带状间隙，但肿胀的Müller细胞数量显著增加（7.17） ± 每200人0.55人 μm，n = 6.P.< 0.05的）in the 12-week diabetic retina, which was largely decreased by 60.5% (2.83 ± 0.68 per 200 μm, n = 6,P.< 0.05的）4. weeks after Ranibizumab treatment, indicating the potential effect of ranibizumab on the reduction of intracellular edema of Müller cells.

Kir4.1在糖尿病进展的大鼠视网膜中表达下调

对糖尿病大鼠视网膜中Kir4.1蛋白表达的检测表明，糖尿病大鼠视网膜中Kir4.1水平在6周时下降了21.0%（图。3.a)， 12周时为46.7%。3.B)，分别与对照相比。

免疫荧光也证实了12周糖尿病大鼠视网膜中Kir4.1的表达降低。从无花果。3.c、 正常对照组中Kir4.1主要表达于内界膜（ILM），并与Müller细胞的特异性标记物GS共定位。然而，在糖尿病视网膜中，Kir4.1的分布被严重破坏，从ILM延伸到外界膜（OLM），免疫染色较弱，尤其是在ILM和视网膜血管周围。测定了Kir4.1和GS的荧光强度，与正常对照组相比，荧光强度降低了57.0%（Kir4.1，n = 5.P.< 0.05)和76.0% (GS, n = 3，P.< 0.05)。

Ranibizumab增加了糖尿病大鼠视网膜中Kir4.1和AQP4的表达水平

为了测试雷尼珠单抗对Kir4.1和AQP4表达水平的影响，对使用或不使用雷尼珠单抗治疗的12周糖尿病大鼠视网膜进行Western blot。4.a，糖尿病大鼠接受雷尼单抗治疗后，Kir4.1蛋白水平较未接受雷尼单抗治疗的大鼠上调47.5%。同样，糖尿病组AQP4表达水平显著下降(较正常对照组下降43.3%)，经雷尼单抗治疗后上调30.9%(图)。4.b）。还评估了糖尿病患者的Müller细胞中GS和GFAP的蛋白质表达水平。糖尿病患者的GS降低23.7％（图。4.c)， GFAP增加222.7%(图3)。4.d） 与对照组相比，表明Müller细胞活化，但谷氨酸代谢能力下降。雷尼珠单抗治疗对GS和GFAP表达无影响。

为了进一步证实Ranibizumab对Kir4.1和GFAP的影响，我们在用ranibizumab处理的糖尿病大鼠视网膜中进行双重免疫染色蛋白质。如图1所示。4.e，正常对照组Kir4.1主要表达于ILM及血管周围，与Müller细胞的另一标记物GFAP共定位。然而，在12周的糖尿病大鼠视网膜中，Kir4.1的表达降低，分布改变;尤其在ILM及周围血管中可见一种减弱的染色模式。12周糖尿病大鼠视网膜Müller细胞GFAP免疫染色呈放射状增加。Ranibizumab治疗增加Kir4.1表达并维持其分布，但对GFAP无影响(图。4.e).上述免疫染色也进行了量化，与正常对照组相比，Kir4.1的荧光强度降低了57.0% (n = 5，P.< 0.05)， 12周后糖尿病大鼠视网膜病变增加75.0% (n = 5，P.< 0.05)。4.f).另一方面，GFAP的荧光强度增加了67.1% (n = 3，P.< 0.05的）in diabetic retinas, which remained unchanged after ranibizumab treatment (n = 3,P.> 0.05,无花果。4.g），与蛋白质印迹一致（图。4.d)。

在乙二醛处理的rMC-1细胞中，雷尼珠单抗降低VEGF-A并增加Kir4.1、AQP4和Dp71的蛋白表达水平

为了进一步证实上述观察结果，我们采用乙二醛处理的rMC-1细胞模拟糖尿病状态。5.，用不同剂量的乙二醛处理rMC-1细胞(图。5.a)不同时间点(图。5.B)优化乙二醛处理条件。不同剂量乙二醛处理24 h后，细胞活力分别下降0.3% (0.1 mM)、5.2% (0.25 mM)、15.3% (0.5 mM)、23.4% (1 mM)、59.2% (2 mM)和97.4% (5 mM)。乙二醛(1 mM)在不同时间点处理细胞后，细胞活力分别短暂提高2% (1 h)、3.1% (3 h)、6.4% (6 h)、16.1% (12 h)、23.4% (24 h)和46.0% (36 h)。基于我们的细胞活力测定，我们选择了1mm乙二醛，处理24小时进行后续研究。

用乙二醛(1 mM)处理rMC-1细胞时，与正常对照组相比，Kir4.1 mRNA表达量分别为118.1% (1 h)、93% (3 h)、25.6% (6 h)、11.5% (12 h)、17.7% (24 h)(图1)。5.c). Western blot结果显示，乙醛处理后12和24 h, Kir4.1蛋白水平分别下降27.2和51.0%(图2)。5.d)。

为研究雷尼单抗对rMC-1细胞的影响，分别用雷尼单抗处理或不处理乙二醛处理的rMC-1细胞，评估VEGF-A、Kir4.1、AQP4、Dp71和GS的mRNA和蛋白水平。尽管乙醛处理后细胞活力呈时间依赖性下降(图。5.b)， VEGF-A表达在12和24 h均增加(图。6.在乙醛处理组中，VEGF-A的mRNA水平在12和24 h分别升高了54.4和26.4%(图2)。6.a). VEGF-A蛋白水平在同一时间点分别升高44.4和78.9%(图4)。6.b）。在Ranibizumab处理后，细胞培养物上清液中的VEGF-A水平显着下降（图。6.c)。

KIR4.1，AQP4，DP71和GS的mRNA水平（图。7.和无花果。8.）在乙二醛处理基团中也显着降低，即，减少82.2％（KIR4.1），71.1％（AQP4），52.6％（DP71）和53.6％（GS）。在Ranibizumab治疗后，其增加了210.4％（Kir4.1），65.0％（AQP4），36.9％（DP71），分别减少了5.7％（GS）。蛋白质表达的变化遵循类似的模式。kir4.1，aqp4，dp71和gs的蛋白质水平（图。7.和无花果。8.）在乙二醛处理基团中分别在血氧处理基团中减少36.0％（KIR4.1），42.2％（AQP4），41.4％（DP71）和26.9％（GS），其增加39.5％（KIR4.1），在Ranibizumab治疗后，分别为70.5％（AQP4），34.9％（DP71）和2.4％（GS）。kir4.1的变化（图。7.c)和AQP4(图。7.F)也经免疫荧光证实。

外源VEGF-A降低了在RMC-1细胞中KIR4.1的表达

为了研究血昔治疗的RMC-1细胞中的VEGF-A是否可以降低kir4.1表达，我们将RMC-1细胞与重组人VEGF-A（RH-VEGF-A）处理过。在图1中。9.a，不同剂量的rh-VEGF-A处理均显著提高细胞活力，如细胞活力分别提高29.8% (1 ng/mL)、32.9% (10 ng/mL)和32.4% (100 ng/mL)。Kir4.1蛋白表达水平被rh-VEGF-A剂量依赖性降低，分别降低23.1% (50 ng/mL)和38.6% (100 ng/mL)，表明在乙二醛处理的rMC-1细胞中，Kir4.1的下调可能部分是由于VEGF-A的增加引起的(图)。9.b）。由于Ranibizumab对细胞活力没有影响（图。9.c），Ranibizumab的kir4.1的增加进一步证实了VEGF-A对KIR4.1的因果作用。我们还检测到RH-VEGF-A处理后AQP4和DP71的变化，但发现这两种蛋白质没有显着变化（数据未显示）。

Ranibizumab通过钠外流降低细胞内渗透压

为了检测ranibizumab是否可以通过降低渗透压来防止Müller细胞胞内水肿，我们使用相应的指标(PBFI和SBFI)检测细胞内钾和钠水平。与对照组相比，乙二醛(1 mM)处理24 h后，细胞内钾水平显著升高，而细胞内钠水平相对保持不变(图2)。10）。然而，当用Ranibizumab处理时，细胞内钠水平，但不是钾，显着降低。因此，除了上调Kir4.1之外，细胞内渗透压的降低可能是另一种机制，Ranibizumab是防止博士中Müller细胞的细胞内水肿。为了进一步探讨可能的原因，我们对Western印迹进行了检测NA的蛋白表达⁺- k⁺- atp酶在乙二醛处理的rMC-1细胞中，有或没有雷尼单抗治疗。从无花果。10c，与正常对照相比，Na⁺- k⁺-乙醛治疗组ATP酶的表达没有变化，而雷尼珠单抗治疗组ATP酶的表达增加了20.6%，具体机制有待进一步探讨。

DME是博士患者失明的主要原因。¹⁵抗vegf治疗已成为改善DME患者视网膜微结构和功能的有效治疗方法。进一步研究DME抗vegf治疗的潜在机制，探索其他有效的治疗方法具有重要意义。在本研究中，我们发现糖尿病视网膜中VEGF-A的增加，Kir4.1, AQP4和Dp71的减少导致了Müller细胞中可见的细胞内水肿。VEGF-A的增加可能是Kir4.1、AQP4和Dp71下调的启动因子或原因，因为通过雷尼单抗结合VEGF-A可以逆转它们的表达改变。雷尼单抗的作用与Müller细胞的胶质状态无关，因为雷尼单抗对Müller细胞中GS和GFAP的表达均无影响。除了直接结合VEGF-A外，雷尼单抗还可以降低细胞内钠水平，降低渗透压，从而防止细胞内水肿。

DME发病机制复杂。体内BRB的破坏、Müller细胞和RPE功能障碍均参与了DME的发病。Müller细胞像水泵一样，借助Kir4.1和AQP4的正态分布和功能，将离子和水排入玻璃体和视网膜血管。据报道，在6个月大的糖尿病大鼠视网膜中，Kir4.1的分布发生改变，其分布在整体上下降，特别是在OLM和血管周围。²²另一项研究发现，在3个月大的糖尿病大鼠的血管周围区域和ILM中Kir4.1缺失。²³然而，大多数研究使用免疫荧光法关注这些通道的分布，但在DR中很少报道蛋白质表达水平。在本研究中，我们发现12周糖尿病大鼠视网膜中Kir4.1和AQP4的蛋白质水平显著降低，Kir4.1的免疫荧光显著降低，尤其是在这些结果表明，Kir4.1和AQP4的表达水平降低以及重新分布可能导致Müller细胞功能障碍，从而损害视网膜的水和离子运输，从而导致DR.Up中Müller细胞的细胞内水肿-地塞米松对Müller细胞中Kir4.1和AQP4的调节在手术诱导的BRB破裂模型中保护视网膜免受水肿。²⁴这些数据支持Kir4.1和AQP4在Müller细胞胞内水肿形成中发挥重要作用。其他研究也报道抗vegf治疗可上调原代大鼠Müller细胞Kir4.1和AQP4的表达水平。²⁵这些结果为在Müller细胞中上调Kir4.1和AQP4处理DME奠定了基础。

雷尼珠单抗是一种重组人源化中和抗体片段，直接结合VEGF-a的所有亚型。在许多临床试验中，它被证实是一种有效的治疗黄斑水肿的方法。²⁶除了与VEGF-A的结合之外，清除累积流体的详细机制尚不清楚。我们假设除了其对BRB的影响外，抗VEGF治疗可能会通过视网膜脉管系统提高Müller细胞将水和离子输出水和离子的“泵送”能力，保持视网膜的稳态。在本研究中，我们发现Ranibizumab通过VEGF-A的结合，通过UP-COMMEDING KIR4.1，AQP4和DP71从水肿中受到保护的Müller细胞。

离子积累被认为是细胞内水肿的第一步。Kir4.1的下调会减弱钾的外流，导致钾的积累，增加细胞内渗透压。水在渗透压的驱动下通过AQP4进入Müller细胞，导致细胞肿胀。我们发现rh-VEGF使Kir4.1的表达水平降低，而非AQP4和Dp71的表达水平降低(数据未显示)，说明DR中AQP4和Dp71的下调可能受其他因素的调控，而非VEGF。

即使Kir4.1由Ranibizumab上调，虽然kir4.1是kir4.1，但仍然没有降低的意外情况。另一方面，在Ranibizumab治疗后，细胞内钠水平显着下降。可能的解释可以归因于Kir4.1和NA的变化⁺- k⁺腺苷三磷酸酶。Kir4.1使K的外流⁺脱离细胞。因此，在乙二醛处理的RMC-1细胞中，增加K.⁺级别(无花果。10a）可能是由于kir4.1表达减少（图。7.b）由于Na的蛋白质表达⁺- k⁺-Atpase保持不变（图。10c)。在Ranibizumab治疗后，NA⁺水平降低(图。10b)，这可能是由于Na蛋白表达增加⁺- k⁺- atp酶(图)10c），增强Na的流出⁺.同时，K⁺钠离子上调引起的内流⁺- k⁺- atp酶可能被上调的Kir4.1抑制(图4)。7.b），增加k⁺雷尼单抗治疗后流出，导致细胞内K无变化⁺级别(无花果。10一种）。Ranibizumab在减少细胞内钠级别的详细机制进一步研究。其他钾通道或离子通道也可以参与Müller细胞的离子稳态，例如Kir2.1，双向钾通道，这在调节细胞内渗透压方面也起着重要作用。

虽然抗vegf治疗DME是有效的，但据报道，视力的增加和解剖改善之间的相关性很弱。^{27那28那29那30.}视网膜神经元，特别是视锥细胞的丧失可能导致视力下降，即使解剖恢复后视力也无法改善。此外，视网膜神经元的缺失可能导致Müller细胞发生胶质细胞反应，GFAP过表达，GS下调。^22那31在我们的研究中，雷尼单抗在体内和体外均未影响细胞活力和GFAP、GS的表达，说明雷尼单抗对胶质反应没有影响。因此，开展DME的综合治疗具有重要意义，如用抗vegf药物减轻视网膜水肿，同时用神经营养因子保护视网膜神经元或调节Müller细胞的胶质状态。

我们的数据显示，随着糖尿病进展降低了Kir4.1，AQP4和DP71的视网膜蛋白表达水平，并且还改变了这些蛋白质的分布，导致Müller细胞在实验DR中具有细胞内水肿的功能障碍。Ranibizumab通过结合VEGF-A通过UP调节KIR4.1，AQP4和DP71的表达来保护ranibizumab受到细胞内水肿的影响。它也可以增加Na的蛋白质表达⁺- k⁺- atp酶，从而降低Müller细胞的细胞内渗透压。因此，本研究拓宽了我们对DME抗vegf治疗机制的认识，并通过靶向Kir4.1和AQP4为DME的治疗提供了线索。

1. 1.

   糖尿病大鼠视网膜中Kir4.1和AQP4表达下调。

2. 2.

   Ranibizumab增加了糖尿病大鼠视网膜和乙二醛处理的rMC-1细胞中Kir4.1和AQP4的表达水平。

3. 3.

   Ranibizumab通过调节钠外流与VEGF-A结合，减少细胞内水肿。

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文中。

不适用。

国家自然科学基金项目(no . 81570852, no . 81970810, no . 81970811);“三五”国家重大科技专项“重大新药开发”项目(no . 2019ZX09301113)。

作者指出

1. 徐国通、刘林、张景发等人对该作品贡献巨大。

从属关系

1. 200127上海市浦东新区浦建路160号上海交通大学医学院附属仁济医院眼科

   王天琴，江梦萌，刘林

2. 200080上海市虹口区海宁路100号上海交通大学附属上海综合医院(上海市第一人民医院)眼科

   张朝阳，张景发

3. 国家眼科临床研究中心;上海市眼底病重点实验室，上海市视觉科学与光医学工程中心，上海市眼病精准诊疗工程中心，上海

   张朝阳，张景发

4. 同济大学同济大学医学院，1239年上海市623号医学院，200092

   谢海，田海斌，卢丽霞，徐国通

贡献

所有的作者都对研究的构思和设计做出了贡献。材料准备、数据收集和分析由王天勤、张朝阳、谢海完成。初稿由王天勤、张景发撰写，所有作者都对初稿进行了修改。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应到郭彤徐那林刘或景河张．

伦理批准和同意参加

根据ARVO眼科和视力研究使用动物声明和动物护理和使用指南(国家研究委员会和同济大学)对动物进行治疗。本方案经同济大学动物实验伦理委员会批准(许可证号:TJHBLAC-2020-06)。

同意出版物

参加者已同意将个案报告提交本刊。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

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重印和权限